IPTG (izopropil-β-D-tioqalaktozid) yüksək induksiya qabiliyyətinə malik β-qalaktosidaza substratının analoqudur.IPTG induksiyası altında induktor repressor zülalı ilə bir kompleks yarada bilər, beləliklə, repressor zülalının uyğunluğu dəyişdirilir, hədəf gen ilə birləşdirilə bilməz və hədəf gen səmərəli şəkildə ifadə edilir.Beləliklə, təcrübə zamanı IPTG konsentrasiyası necə təyin edilməlidir?Nə qədər böyük o qədər yaxşıdır?
Əvvəlcə IPTG induksiyasının prinsipini anlayaq: E. coli-nin laktoza operonu (elementi) müvafiq olaraq β-qalaktosidaza, permeaz və asetiltransferazanı kodlayan üç struktur gendən, Z,Y və A-dan ibarətdir.lacZ laktozu qlükoza və qalaktoza və ya allo-laktozaya hidroliz edir;lacY mühitdəki laktozanın hüceyrə membranından keçməsinə imkan verir və hüceyrəyə daxil olur;lacA asetil qrupunu asetil-KoA-dan β-qalaktozidə köçürür, bu da Toksik effekti aradan qaldırır.Bundan əlavə, əməliyyat ardıcıllığı O, başlanğıc ardıcıllığı P və tənzimləyici gen I var. I gen kodu operator ardıcıllığının O mövqeyinə bağlana bilən repressor zülaldır ki, operon (meta) repressiyaya məruz qalır və söndürüldü.P başlanğıc ardıcıllığının yuxarı hissəsində katabolik gen aktivatoru zülal-CAP bağlayan yer üçün də bağlanma yeri var. P ardıcıllığı, O ardıcıllığı və CAP bağlanma yeri birlikdə lak operonun tənzimləyici bölgəsini təşkil edir.Üç fermentin kodlaşdırıcı genləri, gen məhsullarının koordinasiya olunmuş ifadəsinə nail olmaq üçün eyni tənzimləyici bölgə tərəfindən tənzimlənir.
Laktoza olmadıqda, lak operon (meta) repressiya vəziyyətindədir.Bu zaman PI promotor ardıcıllığının nəzarəti altında I ardıcıllığı ilə ifadə olunan lak repressor O ardıcıllığına bağlanır, bu da RNT polimerazanın P ardıcıllığına bağlanmasının qarşısını alır və transkripsiya başlanmasına mane olur;laktoza mövcud olduqda, lak operon (meta) induksiya edilə bilər Bu operon (meta) sistemində əsl induktor laktozanın özü deyil.Laktoza hüceyrəyə daxil olur və allolaktoza çevrilmək üçün β-qalaktozidaza tərəfindən katalizlənir.Sonuncu, induktor molekulu olaraq, repressor zülalına bağlanır və zülal konformasiyasını dəyişir, bu da repressor zülalının O ardıcıllığından və transkripsiyasından ayrılmasına səbəb olur.İzopropiltioqalaktozid (IPTG) allolaktoza ilə eyni təsirə malikdir.Bu, çox güclü induktordur, bakteriyalar tərəfindən metabolizə olunmur və çox sabitdir, buna görə də laboratoriyalarda geniş istifadə olunur.
IPTG-nin optimal konsentrasiyasını necə təyin etmək olar?Məsələn, E. coli-ni götürək.
Tərkibində müsbət rekombinant pGEX (CGRP/msCT) olan E. coli BL21 gen mühəndisliyi ştammı 50μg·mL-1 Amp olan LB maye mühitinə əkilmiş və gecə ərzində 37°C-də becərilmişdir.Yuxarıdakı kultura genişlənmə kulturası üçün 1:100 nisbətində 50μg·mL-1 Amp olan 10 şüşə 50ml təzə LB maye mühitinə aşılanmış və OD600 dəyəri 0,6~0,8 olduqda, son konsentrasiyaya IPTG əlavə edilmişdir.0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1-dir.Eyni temperaturda və eyni zamanda induksiyadan sonra ondan 1 ml bakterial məhlul götürüldü və bakteriya hüceyrələri sentrifuqa yolu ilə toplandı və müxtəlif IPTG konsentrasiyalarının zülal ifadəsinə təsirini təhlil etmək üçün SDS-PAGE-ə məruz qaldı və sonra ən böyük protein ifadəsi ilə IPTG konsentrasiyasını seçin.
Təcrübələrdən sonra məlum olacaq ki, İPTG konsentrasiyası mümkün qədər böyük deyil.Bunun səbəbi IPTG-nin bakteriyalar üçün müəyyən toksikliyinə malik olmasıdır.Konsentrasiyanı aşmaq da hüceyrəni öldürəcək;və ümumiyyətlə desək, ümid edirik ki, hüceyrədə nə qədər çox həll olunan zülal ifadə edilsə, bir o qədər yaxşıdır, lakin bir çox hallarda IPTG konsentrasiyası çox yüksək olduqda, böyük miqdarda daxilolma meydana gələcək.Bədən, ancaq həll olunan protein miqdarı azaldı.Buna görə də, ən uyğun IPTG konsentrasiyası çox vaxt nə qədər böyükdürsə, bir o qədər yaxşıdır, əksinə konsentrasiyanın aşağı olmasıdır.
Gen mühəndisliyi ilə hazırlanmış suşların induksiyası və becərilməsinin məqsədi hədəf zülalın məhsuldarlığını artırmaq və xərcləri azaltmaqdır.Hədəf genin ifadəsinə təkcə ştammın öz faktorları və ifadə plazmidi deyil, həm də induktorun konsentrasiyası, induksiya temperaturu və induksiya vaxtı kimi digər xarici şərtlər də təsir edir.Buna görə də, ümumiyyətlə, naməlum bir zülal ifadə edilməzdən və təmizlənməzdən əvvəl, uyğun şərtləri seçmək və ən yaxşı eksperimental nəticələri əldə etmək üçün induksiya vaxtını, temperaturu və IPTG konsentrasiyasını öyrənmək ən yaxşısıdır.
Göndərmə vaxtı: 31 dekabr 2021-ci il